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如何对付使用抗体遇到的问题点击次数:777 发布时间:2011-05-13

 

  不得不承认,这里的问题都是因为流式抗体才引申出来的,之前的时候只是了解流式抗体,拥有什么样的特性、如何的使用等等的一些问题那么如何解决使用抗体过程遇到的问题呢?

  比如说,*、如何选择合适的一抗?

 

  请先确定您要检测的种属和使用的实验方法,然后查找相关产品,根据说明书上描述的适用种属和实验方法来确定合适的抗体。如果说明书中有明确您要检测的种属和实验方法均经过检测,则您可以放心地购买该产品。

  第二、如何选择合适的二抗?

 

  二抗的选择原则:

 

  针对一抗Ig亚型的(比如一抗是IgM,二抗就要是抗IgM的抗体)

  针对一抗来源的二抗(比如一抗是小鼠来源的,二抗就要是抗小鼠的)

  为了增加特异性、降低背景:可以选择Fab段的抗体(去除Fc段的)、经过标本来源种属血清吸附的的二抗

  查看二抗的说明书,选择经过验证可以用于相应实验方法的二抗

  

  第三、如何确定一抗的稀释比例?

 

  如果说明书中有推荐的稀释比例,请按照该稀释比例进行实验。但是由于标本类型、实验条件、操作环境等各种因素的影响,推荐浓度仅作为参考。实验者需要在推荐浓度周围进行多个浓度梯度的实验,从中发现*的稀释比例。

  

  如果说明书没有推荐稀释比例,仅注明“Useatanassaydependentdilution”,就需要做大量的预实验来摸索*的比例了。下表列出的纯化抗体抗体用于不同实验方法时常用的工作浓度,可以作为预实验的参考。未纯化的抗体一般在说明书中不会标明抗体的浓度,因为大部分全抗血清、培养上清或腹水形式的产品浓度都是没有经过测定的。如果未纯化抗体产品的说明书中没有标明其中特异性抗体的浓度,实验者可以参考下表中估计浓度确定各种实验稀释比例。

  

  第四、如何选择同型对照?

 

  同型对照的主要目的是确定一抗的结合是特异性的,而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。同型对照要与一抗的来源、Ig分型和标记完全一致。例如:一抗是FITC标记,其抗体分型是小鼠的IgG1,则同型对照要选择是FITC标记的小鼠的IgG1。这里如同使用流式抗体一样,同样的不可离开说明书!

  

  多抗的同型对照:

 

  绝大部分的同型对照产品都是单克隆抗体,因此不适用于作为多克隆抗体的对照(因为多抗含有多种IgG的亚型)。

  第五、如何选择阳性对照?

 

  阳性对照的使用是一个实验中确定抗体及检测系统是否正常工作的依据,也是确定待测标本中是否存在待测蛋白的一个依据!尤其是检测的标本是不确定是否有待测蛋白表达时。因此当实验没有阳性结果出现时,的选择是实验合适的阳性对照。

  

  说明书上都有推荐的阳性对照。但是如果说明书上没有推荐时,请参考以下条款:

 

  看看说明书中是否有Abreviews。任何被其他客户成功检测的组织、细胞或者裂解物均可以作为合适的阳性对照!

  根据说明书上的Swiss-ProtOmnigene数据库来查找。这些数据库经常会列出该蛋白表达的组织,这也可以作为合适的阳性对照!

  查查该蛋白的GeneCards吧,这里通常会有蛋白在不同组织的表达水平。

 

  对于不同的问题,不同的测试,相关性的不同的性能,拿流式抗体来说,在使用的过程中要特别谨说明书使用!

  

  

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