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亚“G1”峰检测法检测细胞凋亡点击次数:1507 发布时间:2011-05-16

                                      亚“G1”峰检测法检测细胞凋亡

处于增殖周期中的细胞,根据其所处不同周期时相(Go/G1、S、G2/M),其DNA含量分布在2n~4n之间。发生凋亡的细胞由于核内DNA裂解成许多小片段,在酒精固定后,用细胞膜通透剂使小分子量的DNA片段穿过胞膜,使细胞原有的DNA部分丢失,仅剩下大片段DNA,这些细胞在DNA染色后,用流式细胞分析术检测其DNA含量,会出现一个DNA含量<2n(即<G1期细胞的分布区,称为“亚G1峰”。因此处于“亚G1峰”的细胞代表样品中的凋亡细胞。
【样品来源】
(1)悬浮生长的培养细胞;
(2)贴壁生长的培养细胞经胰蛋白酶消化后的细胞悬液;
(3)离体细胞悬液。
将样品分组,即空白对照组(未经诱导凋亡处理组)和实验组(经诱导凋亡处理组)。
【材料与试剂】
(1)PBS缓冲液;
(2)70%酒精;
(3)DNA抽提缓冲液:取 192ml 0.2mol/L Na2 HPO4 ,与8ml 0.1mol/L枸橼酸混合,调整pH到7.8;
(4)DNA染液:取200μg PI溶于10ml PBS,加入2mg无DNA酶活性的RNA酶。
【操作步骤】
(1)1~5×106 个细胞,用70%酒精固定(-20冰箱),2h以上;
(2)洗涤:离心,弃去酒精,细胞重新悬浮于10ml PBS中,再离心,弃去上清;
(3)DNA片段抽提:将细胞重新悬浮于0.5ml PBS,加入1ml DNA抽提缓冲液,混匀,室温下静置5min,离心,弃去上清;
(4)DNA染色:将细胞重新悬浮于1ml DNA染液,室温下避光染色30min;
(5)流式细胞仪测定:选用波长488nm 蓝色激发光,同时测定红色荧光和前向角散射光;每例样品测定5000~10000个细胞。
注:所有离心步骤均为1000r/min,5min。
【结果分析】
实验组(经诱导凋亡处理组)的 DNA 组方图上,在G1峰前出现一个呈高斯分布的峰(亚“G1”峰),分析峰的百分比即可得出凋亡细胞的百分比;空白对照组因无凋亡发生而不出现亚“G1”峰,或有些细胞系可有自发性细胞凋亡发生,但其百分比不超过5%;发生坏死的细胞或机械性损伤之细胞在G1峰前不出现呈高斯分布的亚“G1”峰,但可出现一个连续的DNA小片段分布曲线,以此可与凋亡区分开来。
处于增殖周期中的细胞,根据其所处不同周期时相(Go/G1、S、G2/M),其DNA含量分布在2n~4n之间。发生凋亡的细胞由于核内DNA裂解成许多小片段,在酒精固定后,用细胞膜通透剂使小分子量的DNA片段穿过胞膜,使细胞原有的DNA部分丢失,仅剩下大片段DNA,这些细胞在DNA染色后,用流式细胞分析术检测其DNA含量,会出现一个DNA含量<2n(即<G1期细胞的分布区,称为“亚G1峰”。因此处于“亚G1峰”的细胞代表样品中的凋亡细胞。
【样品来源】
(1)悬浮生长的培养细胞;
(2)贴壁生长的培养细胞经胰蛋白酶消化后的细胞悬液;
(3)离体细胞悬液。
将样品分组,即空白对照组(未经诱导凋亡处理组)和实验组(经诱导凋亡处理组)。
【材料与试剂】
(1)PBS缓冲液;
(2)70%酒精;
(3)DNA抽提缓冲液:取 192ml 0.2mol/L Na2 HPO4 ,与8ml 0.1mol/L枸橼酸混合,调整pH到7.8;
(4)DNA染液:取200μg PI溶于10ml PBS,加入2mg无DNA酶活性的RNA酶。
【操作步骤】
(1)1~5×106 个细胞,用70%酒精固定(-20冰箱),2h以上;
(2)洗涤:离心,弃去酒精,细胞重新悬浮于10ml PBS中,再离心,弃去上清;
(3)DNA片段抽提:将细胞重新悬浮于0.5ml PBS,加入1ml DNA抽提缓冲液,混匀,室温下静置5min,离心,弃去上清;
(4)DNA染色:将细胞重新悬浮于1ml DNA染液,室温下避光染色30min;
(5)流式细胞仪测定:选用波长488nm 蓝色激发光,同时测定红色荧光和前向角散射光;每例样品测定5000~10000个细胞。
注:所有离心步骤均为1000r/min,5min。
【结果分析】
实验组(经诱导凋亡处理组)的 DNA 组方图上,在G1峰前出现一个呈高斯分布的峰(亚“G1”峰),分析峰的百分比即可得出凋亡细胞的百分比;空白对照组因无凋亡发生而不出现亚“G1”峰,或有些细胞系可有自发性细胞凋亡发生,但其百分比不超过5%;发生坏死的细胞或机械性损伤之细胞在G1峰前不出现呈高斯分布的亚“G1”峰,但可出现一个连续的DNA小片段分布曲线,以此可与凋亡区分开来。

处于增殖周期中的细胞,根据其所处不同周期时相(Go/G1、S、G2/M),其DNA含量分布在2n~4n之间。发生凋亡的细胞由于核内DNA裂解成许多小片段,在酒精固定后,用细胞膜通透剂使小分子量的DNA片段穿过胞膜,使细胞原有的DNA部分丢失,仅剩下大片段DNA,这些细胞在DNA染色后,用流式细胞分析术检测其DNA含量,会出现一个DNA含量<2n(即<G1期细胞的分布区,称为“亚G1峰”。因此处于“亚G1峰”的细胞代表样品中的凋亡细胞。
【样品来源】
(1)悬浮生长的培养细胞;
(2)贴壁生长的培养细胞经胰蛋白酶消化后的细胞悬液;
(3)离体细胞悬液。
将样品分组,即空白对照组(未经诱导凋亡处理组)和实验组(经诱导凋亡处理组)。
【材料与试剂】
(1)PBS缓冲液;
(2)70%酒精;
(3)DNA抽提缓冲液:取 192ml 0.2mol/L Na2 HPO4 ,与8ml 0.1mol/L枸橼酸混合,调整pH到7.8;
(4)DNA染液:取200μg PI溶于10ml PBS,加入2mg无DNA酶活性的RNA酶。
【操作步骤】
(1)1~5×106 个细胞,用70%酒精固定(-20冰箱),2h以上;
(2)洗涤:离心,弃去酒精,细胞重新悬浮于10ml PBS中,再离心,弃去上清;
(3)DNA片段抽提:将细胞重新悬浮于0.5ml PBS,加入1ml DNA抽提缓冲液,混匀,室温下静置5min,离心,弃去上清;
(4)DNA染色:将细胞重新悬浮于1ml DNA染液,室温下避光染色30min;
(5)流式细胞仪测定:选用波长488nm 蓝色激发光,同时测定红色荧光和前向角散射光;每例样品测定5000~10000个细胞。
注:所有离心步骤均为1000r/min,5min。
【结果分析】
实验组(经诱导凋亡处理组)的 DNA 组方图上,在G1峰前出现一个呈高斯分布的峰(亚“G1”峰),分析峰的百分比即可得出凋亡细胞的百分比;空白对照组因无凋亡发生而不出现亚“G1”峰,或有些细胞系可有自发性细胞凋亡发生,但其百分比不超过5%;发生坏死的细胞或机械性损伤之细胞在G1峰前不出现呈高斯分布的亚“G1”峰,但可出现一个连续的DNA小片段分布曲线,以此可与凋亡区分开来。

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