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FITC荧光素标记抗体点击次数:2279 发布时间:2011-06-27

                                                     FITC荧光素标记抗体

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当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时,主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合,形成FITC-蛋白质结合物,即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基,一般zui多能结合15~20个,一个IgG分子可结合2~8个分子的FITC,其反应式如下:
FITC-N=C=S  +  N-H2-蛋白质  →  FITC-NS-C-N-H2-蛋白质
常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体,也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
 
1.Marsshall法
(1)材料:抗体球蛋白溶液、0.5mol/L(pH9.0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7.2或3.0的0.01mol/LPBS等。
(2)方法及步骤   
①抗体的准备:取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中,再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液,使zui后免疫球蛋白浓度为20mg/ml,碳酸盐缓冲液容量为总量的1/10,混匀,将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5~10min。
②荧光素的准备:根据欲标记的蛋白质总量,按每毫克免疫球蛋白加0.01mg荧光色素,用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量,还可以算出需加缓冲液的量。
a.蛋白溶液:含量Amg/m1;容积Bml。
b.总蛋白量(AXB)=Crag。
c.C/20~C/10=Dmg(如蛋白含量低于20mg/ml,用C/10;如高于20mg/ml,用C/20)。
d.荧光素FITC的量:(1/50~2/100)XC=Emg。
e.巳0.5mol/L(pH9.5)碳酸盐缓冲液D/10=Fml。
f. PBS量D-(B+F)=Gml。
注:A为蛋白含量,mg/ml;B为蛋白质溶液的容积;C为蛋白总量,mg;D为常数,mg;正为荧光素的量,mg;F为碳酸盐缓冲液的容积,ml;G为PBS的容积,ml。
③结合(或标记):边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中,避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完),加完后,继续避光搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右,故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析:结合完毕后,将标记的球蛋白溶液离心(2500r/min)20rain,除去其中少量的沉淀物,装入透析袋中,再置于烧杯中,用pH8.0缓冲盐水透析(0~4~C)过夜。
⑤过柱:取透析过夜的标记物,通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱,分离游离荧光素,收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液:0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2);过滤量:12ml标记蛋白液(过滤前未透析);收集量:20ml(稀释1.7倍左右)。
 
2.Chadwick法
(1)试剂和材料:抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0.01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯(25ml)搅拌器、无菌吸管,无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500ml)透析袋等。
(2)方法及步骤
①抗体准备:用o~4~C的pH8。0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30~40mg/ml,置入25ml烧杯内,放于冰槽中。
②荧光色素准备:按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0.01rug计算,称取所需的荧光素,用3%碳酸钠水溶液溶解。
③将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合,充分搅匀,在o~4~C冰箱中结合(在磁力搅拌机上持续搅拌)18~24h。
④透析和柱层析:方法同Marsshall法。
 
3.改良法
(1)试剂和材料
①0.01mol/L(pH7.2)PBS配法中,校定pH至7.2。NaCi 18g、Na2HP04 1.15g,溶于2000ml蒸馏水
②0.5mol/L(pH9.0)碳酸盐缓冲液配法  取0.5mol/LNazCOs(5.3%)10ml加入0.5mol/LNaHC03(4.2%)90ml,混合后,校定pH至9.0。
③3%碳酸钠水溶液配法  称L 5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。
④其他试剂和材料  l%叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。
(2)方法及步骤   
①取价的抗人球蛋白兔免疫血清,分离球蛋白,用盐水(0.15mol/LNaCl)及缓冲液(0.5mol/LNaHC03—Na2C03,pH9.0)稀释使每毫升内含蛋白质lOmg,缓冲液为总量的10%,降温至4℃。
②加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白:荧光素=(50—80)mg/mg],在0~4℃。
下电磁搅拌12~14h。
③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离,除去未结合的荧光素,再用缓冲盐水透析,除去硫酸铵(用Nessler试剂测验,至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。
④将制备好的荧光抗体加叠氮化钠o.01%,分装在lml安瓿中,或冻干,保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上,一20~C保存可达2年以上。
 
4.透析标记法
 
此法适用于小量抗体的荧光素标记,标记简便,非特异性染色较少。
(1)试剂和材料:试剂和材料同改良法。
(2)方法及步骤
①用0.025mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0,将欲标记免疫球蛋白稀释成1%浓度,装入透析袋中。
②用同一缓冲液将FITC配成0.1mg/ml的溶液,按10mg/ml球蛋白溶液体积的10倍,将FITC稀释液盛于圆柱形容器内,并使透析袋浸没于FITC液中。
③容器顶端盖紧,底部放搅拌棒,在4~C电磁搅拌下透析标记24h。取出透析袋中标记液,即刻用SephadexG50凝胶过滤,去除游离荧光素,分装,贮存于4℃中。
电话:
13788993509
13788995069
021-64133189
传真:
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