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使用脂质体2000转染试剂时需要注意什么点击次数:931 发布时间:2018-05-16

       脂质体2000转染试剂的应用越来越广泛,下面我们来说说使用脂质体2000转染试剂时需要注意什么。
  脂质体2000转染试剂操作注意事项:
  1、转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺板,使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清,不含抗生素的正常生长的培养基中。
  2、对于每孔细胞,使用50μl无血清培养基(如OPTI-MEMⅠ培养基)稀释0.8μg-1.0μg DNA。3、对于每孔细胞,使用50μlOPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟(在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。)注意:即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释,细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为Lipofectamine2000的稀释液,必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
  4、混合稀释的DNA(第2步)和稀释的Lipofectamine2000(第3步)。在室温保温20分钟。 注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。
  5、直接将复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。注意:如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基,替换为0.5ml无血清培养基。
  6、在37℃,5%的CO2中保温24-48小时,无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
  7、在细胞中加入复合物24-72小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
  8、对于96孔板培养,不再需要提前一天进行细胞铺板,而可以直接在平板中制备复合物,然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了,这样进一步减少了转染时间。这种改进步骤已经过293-H,293-F,COS-7L和CHO细胞的试验,同传统方法相比活性稍低。快捷的步骤和蛋白表达细胞系的转染使得Lipofectamine2000非常适用于96孔板的高通量转染,比如cDNA文库的筛选和蛋白瞬时表达。
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