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原代细胞核膜的分离点击次数:1422 发布时间:2011-01-24

                                                   原代细胞核膜的分离

试剂和器材www.runwelltac.com: 
1. DNA酶Ⅰ;
2. KCl(1mol/L溶于20mmol/L Tris-HCl,pH7.4);
3. MgCl2(1mol/L储存液);
4. 苯甲基磺酰氟(PMSF)(无水乙醇配制的1mol/L储存液);
5. 纯化的细胞核;
6. 缓冲液:2mmol/L Tris-HCl,pH7.4;
7. 膜悬浮缓冲液(ESB):0.25mol/L蔗糖、2mmol/L Tris-HCl,pH7.4;
8. 梯度溶液:1.0mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L、2.0mol/L的蔗糖溶于2mmol/L Tris-HCl,pH7.4;
9. 除了MgCl2外的所有溶液须含0.1mmol/L苯甲基磺酰氟;
10. Abbé折光计;
11. 高速离心机,配有固定角转子和离心管
12. 超速离心机,配有固定角和吊桶式转子、离心管;
13. 相差显微镜;
14. 紫外分光光度计(配石英比色皿);

实验方法:
   除特殊注明外,所有操作均在0—4℃下进行。
1. 将纯化的原代细胞细胞核浸于缓冲液中孵育10min使之膨大去凝缩。之后约10000g离心10min,用缓冲液重悬沉淀,并重复这一步骤2次;
2. 用含DNA酶Ⅰ(0.01g/L)的缓冲液重悬凝胶样溶胀的细胞核沉淀。充分混匀并室温孵育30min,孵育的中途将上清调节至含约0.1mmol/L MgCl2。随着DNA被切割裂解,染色质很快失去了凝胶状特性。可通过相差显微镜检测核膜“影子”的产生;
3. 采用固定角转子或吊桶式转子,约60000g离心30min;
4. 用缓冲液重悬核膜粗产物,并再次离心。重复这一步直至DNA释放为止(即监测上清在280nm下的吸光度,直至达到一很低平台);
5. 选择性地用KCl溶液洗涤获得地核膜,以加速离子结合蛋白,尤其是组蛋白的去除。然后约60000g离心30min;
6. 将核膜用核膜悬浮缓冲液重悬,覆盖配制的4个梯度溶液,置于吊桶式离心机中离心若干小时或过夜,以收集核膜等密度层;
7. 纯化的核膜应该主要聚集在1.5mol/L与1.8mol/L两蔗糖层的界面,用巴斯德吸管小心地从梯度液中移出核膜层;
8. 通过相差显微镜,或者通过琼脂糖包埋进行负染和/或薄片电镜,检查核膜的完整性;
9. 对纯化标本进行必须的生化分析,如SDS-PAGE或是酶学实验;内源性过氧化物酶是大鼠肝脏核膜的一个合适的标志,同时也存在Mg-ATP酶以及很多内质网酶;www.runwelltac.com


 

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