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碘克沙醇梯度溶液分离细胞核点击次数:3153 发布时间:2011-01-18

                      碘克沙醇梯度溶液分离细胞核

 用碘克沙醇梯度溶液从哺乳动物肝脏中分离细胞核 www.elisa17.com                

试剂和器材: 
1. OptiPrepTM(600g碘克沙醇,ρ=1.32g/ml);
2. OptiPrepTM稀释剂(OptiPrepTM diluent,OD):150mmol/L KCl、30mmol/L MgCl2、120mmol/L*基甘氨酸-KOH,pH7.8;
3. 匀浆介质(HM):0.25mol/L蔗糖、25mmol/L KCl、5mmol/L MgCl2、20mmol/L*基甘氨酸-KOH,pH7.8;按要求向OptiPrepTM稀释剂和匀浆介质中加入蛋白酶抑制剂
4. 高转矩桥式电动机(半导体开关控制);
5. Potter-Elvehjem匀浆器,20—40ml,孔隙约0.07mm;
6. 高速离心机,带可容纳15—50ml离心管的吊桶式转子;
7. 注射器,带金属套管针(内径约0.8mm);
8. 尼龙滤网;
 
实验方法:
   所有操作在0—4℃下进行。
1. 制备500g/L碘克沙醇工作液:每5倍体积OptiPrepTM用1倍体积的OptiPrepTM稀释剂来稀释;
2. 梯度溶液:用匀浆介质(分别为6倍体积+4倍体积和7倍体积+3倍体积)来稀释500g/L碘克沙醇工作液以制备300g/L和350g/L的两种碘克沙醇梯度溶液。保持于冰上。
3. 切除肝脏并用剪刀剪切成微小碎块;
4. 将大约一半肝脏转移到Potter-Elvehjem匀浆器的20ml匀浆介质中,并用研杵研磨约8次,在约500r/min转速下旋转以破碎组织;
5. 对另一半肝脏切碎物重复以上操作;
6. 用尼龙滤网过滤;
7. 通过与等体积的500g/L碘克沙醇工作液混合将匀浆液调整到250g/L碘克沙醇;
8. 将10—15ml匀浆液转移到50ml管中,从300g/L和350g/L的碘克沙醇梯度溶液中各取10ml加到匀浆液之下;
9. 在100000g下离心20min;
10. 细胞核在300g/L和350g/L碘克沙醇界面上成带,用注射器和金属套管针吸取细胞核
11. 用2倍体积的匀浆介质稀释悬液,在2000g下离心10min沉淀细胞核;

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