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胚胎干细胞培养操作规程点击次数:1098 发布时间:2010-12-29

                        胚胎干细胞培养操作规程

维持ES细胞处于未分化状态:

ES细胞培养用含有ESGRO(白血病抑制因子)的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1%明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2-3天从达到80%-90%融合的平板按1:8的比率传代细胞一次,细胞传代以后,在将细胞接种在0.1%明胶包被的培养皿之前,通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时,使分化细胞粘附,从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃,5%CO2,100%湿度条件下培养。


培养基:ES:配制一20×不含DMEM,HS,ESGRO的溶液(该溶液也能用于EB培养基--见下文)。分装在50ml FALCON管中,(稀释为2×,每管42ml),贮存在-20℃。通过将21ml该溶液,HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基,0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。
注:一瓶DMEM是500ml。


贮存液:DMEM(高糖)、马血清(HS)、L-谷氨酰胺(200mM)、MEM NEAA(10mM)、HEPES(1M)、β-巯基乙醇(55Mm)、PEST、ESGRO。
复苏细胞:细胞被冻存在10%二甲基亚砜(DMSO)中防止结晶的形成,结晶的形成会损害细胞。然而,二甲基亚砜对细胞有毒性,快速的进行细胞复苏是很重要的。


操作步骤:
1.从液氮中取出一管细胞;
2.将冻存管置于37℃水浴中2分钟(或放到管内溶液恰好完全溶解);
3.将细胞转移到一15ml Falcon管中;
4.加入5ml ES培养基(用培养基冲洗冻存管);
5.离心3分钟;
6.弃上清,用2ml ES培养基重悬细胞,至少吹打10次;
7.接种在明胶包被(见下文)的6孔或6cm组织培养皿;
8.孵育。


冻存细胞
冻存液:90%HS和10%二甲基亚砜
步骤:
1.1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内;
2.用细胞刮刀收集细胞;
3.将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟;
4.弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中(10cm的培养皿用2ml,15cm的培养皿用6-7ml。)
5.分装于冻存管内,每管1ml;
6.置-80℃过夜,第二天移入液氮。


明胶包被:准备500ml 0.1%明胶溶液
1.将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中(50-65℃水浴15~30分钟)。
2.在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤,贮存在4℃。
包被培养板或培养皿
1.加入足量的明胶溶液覆盖培养平面(15cm培养皿加2ml,10cm培养皿加0.5~1ml,溶液的量并不重要,只要能完全覆盖培养表面就行了。);
2.置室温30分钟;
3.去除明胶溶液,将培养板贮存在包装袋中室温放置,将板子平方,以免明胶污染盖子和流出培养板。

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