胚胎干细胞培养操作规程

维持ES细胞处于未分化状态：

ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。

培养基：ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。
注：一瓶DMEM是500ml。

贮存液：DMEM（高糖）、马血清（HS）、L-谷氨酰胺（200mM）、MEM NEAA（10mM）、HEPES（1M）、β-巯基乙醇（55Mm）、PEST、ESGRO。
复苏细胞：细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

操作步骤：
1．从液氮中取出一管细胞；
2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好*溶解）；
3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
5．离心3分钟；
6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
8．孵育。

冻存细胞
冻存液：90％HS和10％二甲基亚砜
步骤：
1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；
2．用细胞刮刀收集细胞；
3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；
4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）
5．分装于冻存管内，每管1ml；
6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。

明胶包被：准备500ml 0.1％明胶溶液
1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
2．在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。
包被培养板或培养皿
1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能*覆盖培养表面就行了。）；
2．置室温30分钟；
3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。