限制性内切酶综述及分类指南

发现限制性内切酶
      40 年前，当人们研究细菌对抗噬菌体宿主特异性的限制-修饰现象时发现了限制性内切酶。人们普通认为，限制性内切酶能保护细菌不受噬菌体的感染，行使微生物免疫功能。缺乏限制性内切酶的 E. coli  菌株极易被噬菌体感染，但如果这类细菌体内存在限制性内切酶，被成功感染的机率就会明显降低。拥有的限制性内切酶种类越多，保护作用也就越强；一种拥有四、五种不同限制性内切酶的细胞就几乎不受感染。
      *被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的 EcoRI 和 EcoRII，以及来源于流感嗜血杆菌的 HindII 和 HindIII。
      这些酶可在特定位点切开 DNA，产生可体外连接的 DNA 片段。不久，研究者就发现内切酶是研究基因的组成、功能及表达非常有用的工具。
当限制性内切酶的应用在二十世纪 70 年代末开始流传时，以 NEB 为代表的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶。除了某些病毒以外，限制性内切酶仅在原核生物中被发现。如今，人们已经从数以千计的细菌及古细菌中寻找过限制性内切酶。
      原核基因组序列分析数据表明，限制性内切酶在原核生物中普遍存在，所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶。
 

      限制性内切酶的形式多样，小到如 157 个氨基酸的 PvuII，大者甚于 1,250 个氨基酸的 CjeI。在已纯化分类的 3,000 多种限制性内切酶中，已发现 250多种不同序列特异性的内切酶，其中超过 30% 是由 NEB 发现并深入研究的。人们不仅从生化角度分析细胞提取物，也采用计算机分析已知的基因组数据，以期能发现更多的识别未知特异序列的限制性内切酶。
尽管很多新发现的酶的识别序列与已有的一致，即同裂酶，但仍然有许多识别新位点的酶在不断被发现。
       二十世纪 80 年代初，NEB 开始克隆并表达限制性内切酶。克隆技术将限制性内切酶的表达与原有细胞环境分离开来，避免了原细胞中其它内切酶的污染，提高了酶的纯度。此外，克隆技术能提高限制性内切酶的产量，简化纯化过程；而且克隆的基因易于测序分析，其表达蛋白可进行 X- 射线晶体结构分析，有利于进一步鉴定克隆产物。
限制-修饰（R-M）系统
      大多数限制性内切酶常常伴随有一、两种修饰酶（甲基化酶），后者能保护细胞自身的 DNA 不被限制性内切酶破坏。修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同，它们的作用是甲基化每条链中的一个碱基，而不是切开 DNA 链。甲基化所形成的甲基基团能伸入到限制性内切酶识别位点的双螺旋大沟中，阻碍限制性内切酶发挥作用。这样，限制性内切酶和它的“搭档”修饰酶一起组成 R-M 系统。在某些 R-M 系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，它们各自独立行使自己的功能；另一些 R-M 系统本身就是一种大的限制-修饰复合酶，由不同亚基或同一亚基的不同结构域来分别执行限制或修饰功能。

限制性内切酶分类
      按照亚基组成、酶切位置、识别位点和辅助因子等不同，传统上将限制性内切酶分为四大类。然而，蛋白测序的结果表明，限制性内切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则远远不止四类。

Ⅰ型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。
      以前认为Ⅰ型限制性内切酶很稀有，但基因组测序分析发现这类酶其实很常见。尽管Ⅰ型酶在生化研究中很有意义，但其不能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带，因而不具备实用性。

Ⅱ型限制性内切酶能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是*一类用于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。如今看来，这些酶很可能是在进化过程中独立产生的，而非来源于同一个祖先。
      zui常见的 Ⅱ 型限制性内切酶在特异性识别序列内部切割 DNA，如 HhaI、HindIII 和 NotI，商业化酶多属此类。它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称序列；但也有少量的酶与DNA 结合形成异二聚体，识别非对称序列（如BbvCI 识别 CCTCAGC）。一些酶识别连续性序列（如 EcoRI 识别 GAATTC，其中的两个半识别序列是相连的）；而另一些识别非连续性序列（如 BglI 识别GCCNNNNNGGC，其中的两个半识别序列是不相连的）。限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小，亚基约 200-350 个氨基酸。

另一种比较常见的 Ⅱ 型限制性内切酶是所谓的ⅡS 型酶，如 FokI 和 AlwI，它们在识别位点之外切开 DNA。这些酶大小居中，约 400-650 个氨基酸，由 DNA 结合域和切割 DNA 的功能域组成。它们识别连续的非对称序列。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到 DNA 上，与邻近酶分子的切割功能域结合成二聚体，协同切开 DNA链。因此一些ⅡS 型酶在切割含有多个识别位点的 DNA 分子时活性更高。
第三种常见的Ⅱ型限制性内切酶是ⅡG 型限制性内切酶，由限制酶和修饰酶联合组成，分子量较大，通常由 850-1,250个氨基酸组成，在同一蛋白上表现有限制和修饰两种活性。此类酶在其识别序列外进行切割；那些识别连续性序列的 IIG 内切酶、（如 AcuI 识别 CTGAAG）仅在识别位点的一端切割 DNA 链；而那些识别非连续性序列的 IIG 内切酶（如 BglI识别 GCCNNNNNGGC），会在识别位点的两端切割 DNA 链，产生一小段含识别序列的片段。这些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的，N 端为 DNA 切割和修饰域；C 端为一、两个识别特异 DNA 序列的结构域，该域也能以独立的亚基形式存在。这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。

Ⅲ 型限制性内切酶也是一类较大的兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之外切开 DNA 链，并且要求同一 DNA分子中存在两个反向的识别序列以完成切割。这类酶很少能达到*切割。
 

Ⅳ 型限制性内切酶识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。