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单分子测序灵敏检测5-hmC点击次数：2738 更新时间：2011-11-24

                                         单分子测序灵敏检测5-hmC

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对于“神秘”的5-hmC，目前还没有一种测序方法能准确判定它在基因组中的位置。为此，美国芝加哥大学与Pacific Biosciences公司的研究人员合作，利用第三代单分子SMRT测序技术和5-hmC的选择性化学标记方法来高通量检测5-hmC。通过聚合酶动力学带来的宝贵信息，研究人员可直接检测DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。
 
甲基化研究如今开展得如火如荼。除了人们熟知的5-mC，很多研究人员也将目光转向了另一种DNA修饰——5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。5-hmC是5-mC的羟基化形式，1952年在噬菌体DNA中发现。几十年来，羟甲基胞嘧啶的研究一直围绕着它对于噬菌体DNA的保护作用。直到zui近，人们发现它与多个关键的细胞功能有关，包括胚胎干细胞发育、正常的骨髓细胞生成和受精卵发育。
 
若想深入了解5-hmC的生物学功能，必须开发出一种灵敏的测序方法，以揭示它在基因组中的位置。而现有的测序方法，如亚硫酸氢盐测序，无法区分5-mC和5-hmC。为此，美国芝加哥大学与Pacific Biosciences公司的研究人员合作，利用第三代单分子测序技术和5-hmC的选择性化学标记方法来高通量检测5-hmC。该研究成果于11月20日发表在《Nature Methods》在线版上。
 
Pacific Biosciences公司开发的单分子实时（SMRT）DNA测序是一种第三代的测序技术，它利用单个DNA聚合酶分子来开展DNA合成，并监控核苷酸的不断掺入。核苷酸掺入的实时记录，不仅产生了序列读取，还带来了关于聚合酶动力学的宝贵信息。通过这些信息，研究人员能鉴别DNA碱基的修饰。
 
一般来说，聚合酶在修饰碱基周围的速率要比未修饰DNA慢。通过比较每个模板位点的掺入时间、脉冲间持续时间（IPD），可定量比较这一差异。利用这一方法，研究人员可直接检测DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。聚合酶动力学的测定是SMRT测序的内在组成，不会对DNA一级序列的测定有任何不良影响。
 
研究人员还对5-hmC进行了选择性化学标记。首先利用β-葡萄糖苷转移酶为5-hmC引入叠氮修饰，之后通过点击化学（click chemistry）反应安装一个生物素标签。通过这种方法，研究人员富集了基因组中的5-hmC，减少所需的测序量。此外，5-hmC上的大体积标签在SMRT测序中产生了更大的动力学信号，以便在较低覆盖度时更自信地修饰碱基。
 
为了检验这种方法的可行性，研究人员检测了小鼠胚胎干细胞（mESC）中的5-hmC。在选择性标记和富集之后，他们制备了SMRTbell DNA文库，用于鸟枪法SMRT测序，并分析动力学信号。他们检测到清晰的HS-N3-5-gmC信号。由于动力学信号的大幅增加，在单分子读取中可轻松5-hmC的位点，而无需与未修饰的对照样品进行比较。
 
作者认为，这种技术将是研究5-hmC生物学功能的有力方法。
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