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大鼠场景恐惧实验方法点击次数：3195 更新时间：2011-07-04

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       场景恐惧（cued and contextual fear conditioning）是基于巴普洛夫条件反射而建立的。它测定动物学习、记忆不悦经历（aversive experience）和环境暗示之间关联的能力。常用声音或光暗示作为条件刺激（conditioning stimulus，CS），以厌恶性刺激（如足电击）作为非条件刺激（unconditioned stimulus，US），二者配对出现。经过这种CS-US训练，动物不仅学会声音和电击之间存在，而且知道电击和周围环境之间也存在某种（context）。前者为听觉暗示条件恐惧（auditory cue fear conditioning）或暗示条件恐惧（cued fear conditioning），后者为关联条件恐惧（contextual fear conditioning）。恐惧是非灵长类动物少有的几种情感反应之一。动物经历条件恐惧后，当再次接触条件刺激时，会产生一系列的生理反应，包括自主神经紧张、应激激素分泌增加以及防御行为增多，等等。凝滞（freezing）即是动物防御行为的一种，是指动物除呼吸之外没有任何其他活动，犹如在黑夜处于迎面而来的汽车强灯照射之下的惊鹿，一动不动。它被认为是评价啮齿类动物恐惧的可靠指标。

参与条件关联学习过程的脑部结构主要为杏仁核和海马。前者调节恐惧，后者调节与恐惧性事物相关联的学习认知。所以，这一模型主要用于杏仁核和海马依赖的记忆。动物不需要禁水或禁食，且实验设备较为简单，训练时间相对较短。因此，该模型广泛用于转基因小鼠敲除小鼠的行为表型研究。
  • 一、实验设备
包括条件恐惧箱、隔音箱和关联条件箱，由上海欣软信息科技有限公司研发制作。条件恐惧箱包括与箱底格栅地板相联的电击发生器（可产生0.1~1.0mA的各种强度的电击）、声音发生器（可产生宽频的卡嗒声或低频音），并与计算机相联。隔音箱装有一灯、一小风扇（用于通风和产生背景音）以及一个与声音发生器相联的扩音器。隔音箱门上有一猫眼，用于观察操作箱内的动物。一个隔音箱内可放置两个操作箱，这样可同时观测两只动物，但两动物彼此不能互相看见。关联箱由透明有机玻璃制成，有可移动的格栅式地板和纱窗式顶部。为防止动物滑至格栅下面，格栅条之间距离应足够短。对小鼠和年幼大鼠，关联条件箱通常为26cm*21cm*10cm；格栅地板由不锈钢条（直径1.5mm，中央间距小鼠为0.5cm、年幼大鼠为1.2cm）组成。对成年大鼠，关联箱通常为29cm*23.5cm*19.5cm，格栅地板包括16根不锈钢条（直径2.5cm、中央间距为1.25cm）。此外，还有电压计和声强计，用来检测刺激强度。
  • 二、实验方法
分为训练和测试两阶段
（一）训练阶段（*天）
 
1．调试仪器，以确保格栅地板有电流刺激，扩音器有声音刺激，并分别记录电流强度和声音强度（分贝）。
2．将大鼠放入条件恐惧箱2min（A相），记录这zui初2min内动物的凝滞（freezing）时间作基线。
3．接着加入卡嗒声，80Db,30s（B相）。
4．紧接着再给予电击，0.35mA，2s（C相），完成一轮训练。如需要多轮训练，则重复A、B、C三相训练即可。
5．记录整个训练阶段动物凝滞时间（s），用以测量动物的非条件恐惧（unconditioned fear）。
6．将大鼠移开操作箱。用70%的酒精或4%醋酸溶液*清洁操作箱，以备进行下一批动物的训练。
（二）测试阶段 在训练后的第二天进行，包括关联（context）测试、变更关联（altered context）或条件刺激前（pre-conditioning-stimulus，pre-CS）测试以及条件刺激（conditioning stimulus，CS）测试。测试阶段没有电击刺激。关联测试和变更关联测试中也没有听觉条件刺激，但每只动物所用的操作箱应与训练阶段的相同。
1．关联测试 将动物放入箱内，计算机自动记录动物的凝滞行为。若用人工观察，则观察者（应不知道动物的处理或基因型）用静声秒表通过箱门上的猫眼（小窗口）观察动物的行为并计分：凝滞为1分，活动（moving）为0分（也有只记录凝滞时间）。每10秒观察一次，共5min，这样可记录到30次（bout）可能的凝滞（即zui大凝滞得分为30分）。用在这一阶段记录到的、动物在同一操作箱内的凝滞时间测量动物的关联条件恐惧（contextually conditioned fear）。此为关联测试。观察结束后将动物放回笼内，清洁操作箱，进行下一只动物的观察。
2．变更关联测试和听觉条件刺激测试 关联测试1h后进行。操作如下：
（1）将计算机调至所需程序。
（2）操作箱进行如下改造：1用平滑塑料板取代关联条件箱内的格栅地板；2在箱的对角线加一块有色塑料板，这样将长方体的操作箱变成三角体；3改变嗅觉暗示（olfactory cues）。例如，可在箱的一角放一个装有一滴桔子汁或柠檬汁的杯子，或直接将一滴果汁涂于墙上。然后开始变更关联和听觉条件刺激实验。
（3）将动物放入经改造后的关联箱（从关联实验中的*只动物开始）。
（4）启动预置的实验程序，每隔10秒记录动物的凝滞和非凝滞得分（分别为1和0分），共记录3min，即18次可能的凝滞记录（凝滞得分为18）。
（5）加入听觉条件刺激30秒。重复上述记录3分钟。
（6）将动物放回笼子，清洁操作箱，进行下一只动物的测试。
  • 三、结果计算与分析
因为不同类型的学习凝滞时间不同，所以zui常使用百分计：
关联=（关联测试中的凝滞得分/30）*100%
变更关联（条件刺激前）=（变更关联中的凝滞得分/18）*100%
听觉暗示（条件刺激）=（听觉条件刺激中凝滞得分/18）*100%
对每一不同的凝滞测试计分进行重复测量单因素方差分析（ANOVA），从此比较关联和变更关联或听觉暗示之间的条件恐惧程度，并确定组间差异。一般而言，动物在听觉暗示中的凝滞行为要比关联测试的多。在变更关联测试中，由于关联条件箱已被改造得“面目全非”，训练时动物获得的对周围环境的关联几乎不存在，因此，凝滞行为应该zui少。关联与变更关联差别很大，凝滞计分差别越大。
如果动物在第二天的关联测试和听觉暗示测试中出现凝滞，而在变更关联测试中不表现凝滞行为，则可认定：动物的感觉和运动功能均正常；能记住前一天与厌恶刺激配对出现的暗示信号；能分辨前一天不与厌恶刺激配对出现的暗示信号，说明动物具有正常的记忆。这些测试中的任何一项增强或减弱，提示调节记忆情感部分的神经解剖、神经递质和基因可能发生变化。
电话：
13788993509
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021-64133189
传真:
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