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RNA提取注意事项点击次数:5445 发布时间:2010-09-09

                                              RNA提取注意事项

 

一般注意事项

一些RNA提取方法,在进行具体实验时,应根据研究对象的性质,提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作一定的修改。
1、 在核酸提取时,为了增加细胞的裂解度,增加核蛋白复合体破碎度,以释放更多的游离核酸,在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K,在确保没有核酸水解酶存在的前提下,酶反应时间越长越好。
2、有时在使用蛋白酶时,为了抑制核酸水解酶的降解作用,可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL,并且可将反应温度提高到50-60℃,并将反应时间缩短到15-25min,但酶用量必须提高10-20倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA,因游离金属离子对酶有抑制。
3、许多植物材料中富含酚,在细胞破碎时,在多酚氧化酶作用下,被氧化成有色的锟类物资,影响核酸的提取及降低提取质量,在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体,在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。
4、 许多生物材料在提取核酸时,都会遇到多糖的污染问题,具体表现为有机溶剂沉淀时,沉淀很多,但复溶时,大量沉淀不溶,电泳观察时核酸含量很低。
     克服多糖污染可采用以下一些办法
1) CTAB多次抽提。
2) 在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度(可到10倍左右),对低浓度样品再进行沉淀。
3)在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂,此时氯化钠的用量可用到1/5-1/2的体积,异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时,高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中,从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作,因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
5、在核酸提取时,酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿,但酚与水有一定的互溶,因此酚抽后,除可能损失部分核酸外,水相中还会残留酚,而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制,因此在操作中可单用氯仿作变性剂、也可用酚/氯仿混合变性,也可用单一酚作变性己,但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。
6、 在操作中当加入变性剂氯仿后,为了保证核酸样品的完整性,操作要轻,尤其在提DNA时,更要避免剧烈操作。
7、 在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇,乙醇的极性要强于异丙醇,所以一般用2V乙醇沉淀,但在多糖、蛋白含量高时,用异丙醇沉淀可部分克服这种污染,尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。
8、 在提取核酸时,如样品浓度低,则应增加有机溶剂沉淀时间,-70℃下>30min;-20℃过夜将有助于增加核酸的沉淀量。
9、 在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高,而到高度纯化后低温保存时复溶于TE缓冲液中,因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存,低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。
10、 核酸提取后可通过PCR 、RT-PCR直接扩增出目的基因片断,也可首先构建文库、然后由RACE、dd-PCR等差异显示技术、AFLP等标记技术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针,再用此探针从文库中筛选出完整基因。
11、 在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数.提取RNA请尽量在低温下操作,如果条件不容许,在室温下操作的时间要尽可能的短。

针对酶的一些注意事项

防止RNA酶污染的措施:
1、 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。
3、 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。
4、 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5、  操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。
6、 设置RNA操作实验室,所有器械等应为。
7、 DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理
8、 加样原则是DNAzui后加,其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同,那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面,混合均匀之后再分装到各个管子里去,这样可以有效地避免误差及污染。
9、 普通实验室容易污染,且污染程度很高,与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系,zui容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。因此要格外注意一些。

常用的RNA酶抑制剂:
1、 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。

2、 异硫氰酸胍:目前被认为是zui有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。
3、 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4、 RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。
5、其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA,因此在分离和纯化RNA过程中不能使用,而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在所有RNA实验中,zui关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。

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