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配制percoll细胞分离液点击次数:1188 发布时间:2010-08-31

                                                               配制percoll细胞分离液

(一) 原理

Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm/kg H2O), 粘度也很小,可形成高达1.3g/ml密度,采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200~1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由 于Percoll扩散常数低,所形成的梯度十分稳定。此外,Percoll不穿透生物膜,对细胞无毒害,因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒, 还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

(二)操作方法及注意事项

1.不同浓度(密度)Percoll溶液的制备: 先用9份Percoll与1份8.5% NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压,然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀释到所需浓度。

Percoll浓度(%)  70    60    50    40    30     20

比重g/ml   1.090         1.077         1.067          1.056            1.043               1.031

2.  不连续密度梯度Percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润,除去多余血清,这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下,使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从 高密度向低密度逐层放置,有时相邻两层Percoll比重相差不大时,可将Percoll液放入注射器中,小针头斜面紧贴管壁,任其自然慢慢流下。

3. 装样:样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异,一般加样体积不宜过大,细胞浓度也不可过高,否则会影响细胞的分离和回收。

4. 离心:一般采用离心力为400g,时间20~25min。由于多层Percoll之间密度差别不大,因此离心机加速、降速时要慢,要平稳。

5. 取样:当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时,可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。

(三)分离纯化细胞举例

1. 富含NK活性大颗粒淋巴细胞(LGL)的纯化:按顺序由下向上逐层加50%、47.5%、45%、42.5%和40%五种不同密度的 Percoll,如用10ml试管(或塑料管)分离,每层Percoll约1.2~1.5ml,初步从外周血中分离的PBMC细胞1×108悬于1ml培 基中,按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5%与45%Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。

2. 纯化淋巴母细胞和除去死细胞:分别叠加50%和30%Percoll液。收取经PHA(或其它抗原、有丝分裂原)刺激PBMC,或含有较高比例异 型的PBMC(如肾综合征出血热患者),按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞;两层Percoll之间为淋巴母细胞,纯度和回收率在 80%以上,位于30%Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。

(四) 人不同血细胞的漂浮密度

表   人不同血细胞的漂浮密度

──────────────┬──────────────────

细 胞   漂浮密度    │ 细 胞       漂浮密度

──────────────┼──────────────────

红细胞  1.09-1.11    │淋巴细胞       1.052-1.077

粒细胞           │ B淋巴细胞      1.062-1.075

嗜酸性  1.09-1.095    │ T淋巴细胞      1.065-1.077

嗜中性  1.080-1.085   │ 淋巴母细胞     1.065-1.077

单核细胞 1.050-1.066   │自然杀伤细胞     1.050-1.070

血小板  1.030-1.060   │

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