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用elisa试剂盒检测样本的原理和步骤 点击次数:2433 发布时间:2010-08-16

                                                     用elisa试剂盒检测样本的原理和步骤

ELISA法定量检测人细胞液、体液以及组织匀浆中8羟基脱氧鸟苷的含量。

试剂组成

包被平底微孔板,酶结合物,生物素,标准品,显色剂A,显色剂B,终止液,浓缩洗涤液(100倍稀释),使用说明书

名称

规格

数量

保存

包被平底微孔板

96孔

1可拆卸板

2-8℃密封冷藏

酶结合物

10毫升

1瓶

2-8℃冷藏

生物素

1ml

1瓶

2-8℃冷藏

标准品

1毫升

6瓶

2-8℃冷藏

显色剂A

6毫升

1瓶

2-8℃冷藏

显色剂B

6毫升

1瓶

2-8℃避光冷藏

终止液

6毫升

1瓶

2-8℃冷藏

浓缩洗涤液(100倍稀释)

10毫升

1瓶

2-8℃冷藏

使用说明书

 

1份

 

名称

规格

数量

保存

包被平底微孔板

96孔

1可拆卸板

2-8℃密封冷藏

酶结合物

10毫升

1瓶

2-8℃冷藏

生物素

1ml

1瓶

2-8℃冷藏

标准品

1毫升

6瓶

2-8℃冷藏

显色剂A

6毫升

1瓶

2-8℃冷藏

显色剂B

6毫升

1瓶

2-8℃避光冷藏

终止液

6毫升

1瓶

2-8℃冷藏

浓缩洗涤液(100倍稀释)

10毫升

1瓶

2-8℃冷藏

使用说明书

 

1份

 

名称

规格

数量

保存

包被平底微孔板

96孔

1可拆卸板

2-8℃密封冷藏

酶结合物

10毫升

1瓶

2-8℃冷藏

生物素

1ml

1瓶

2-8℃冷藏

标准品

1毫升

6瓶

2-8℃冷藏

显色剂A

6毫升

1瓶

2-8℃冷藏

显色剂B

6毫升

1瓶

2-8℃避光冷藏

终止液

6毫升

1瓶

2-8℃冷藏

浓缩洗涤液(100倍稀释)

10毫升

1瓶

2-8℃冷藏

使用说明书

 

1份

 

名称

规格

数量

保存

包被平底微孔板

96孔

1可拆卸板

2-8℃密封冷藏

酶结合物

10毫升

1瓶

2-8℃冷藏

生物素

1ml

1瓶

2-8℃冷藏

标准品

1毫升

6瓶

2-8℃冷藏

显色剂A

6毫升

1瓶

2-8℃冷藏

显色剂B

6毫升

1瓶

2-8℃避光冷藏

终止液

6毫升

1瓶

2-8℃冷藏

浓缩洗涤液(100倍稀释)

10毫升

1瓶

2-8℃冷藏

使用说明书

 

1份

 

名称

规格

数量

保存

包被平底微孔板

96孔

1可拆卸板

2-8℃密封冷藏

酶结合物

10毫升

1瓶

2-8℃冷藏

生物素

1ml

1瓶

2-8℃冷藏

标准品

1毫升

6瓶

2-8℃冷藏

显色剂A

6毫升

1瓶

2-8℃冷藏

显色剂B

6毫升

1瓶

2-8℃避光冷藏

终止液

6毫升

1瓶

2-8℃冷藏

浓缩洗涤液(100倍稀释)

10毫升

1瓶

2-8℃冷藏

使用说明书

 

1份

 

 

自备物品

1.酶标仪(尽量提前预热)

2.微量加液器、吸头

3.蒸馏水或去离子水以及滤纸

样本的采集及保存

一般的生物标本包括有:

血液、体液、内脏器官、粪便、胃液、活检组织、组织提取液、天然孔分泌物及各种表达系统的表达产物等

一般为无菌操作,低温保存(-80℃、液氮)

一.如果采集的实质器官则要求:

1、   器官实质不能太小

2、   以采集实质性病灶区为佳:如淋巴结、心脏、非、肺、脾以及肠管等病毒、病菌聚集的地方为佳

3、   同一病例装入同一容器,并做好标记

4、   应在0-8℃的低温储存和运输

5、   实质性器官的处理:

5.1、取实质性器官约0.5mg左右,充分剪碎或研磨

5.2、加入约500ul的PBS/生理盐水,充分混匀

5.3、离心5000rmp x10min,去上清

5.4、-20℃保存,作为待检标本(切勿反复冻融)

二.体液(常见的包括血清、血浆、唾液以及尿液等)的处理方式

1、血液包括血浆和血清,它们的主要区别就是:血清凝血而血浆不凝血,所以它们的处理方式也就不一样

1.1、采集血浆时一般不加抗凝剂(主要为枸橼酸盐和柠檬酸盐),采集后立即离心800-1000rmp x 5min分离,取上清,-20℃或4℃保存备用;

1.2、如要采集血清,一般要加入总体积1%的抗凝剂,采集后先室温或4℃静置半小时后,800-1000rmp x 5min分离,取上清,-20℃或4℃保存备用;

2、胃液和唾液的采集方式一般现采现用,但是一般饭后半小时内不易采集,因为刚进食的唾液中富含丰富的唾液淀粉酶,的采集的时间时空腹采集;

3、尿液的采集方式基本和唾液一样的,即现采现用,但是一般隔夜尿不采集;

4、组织提取液如肺泡灌洗液等,采集后离心分离,800-1000rmp x 5min,取上清,-20℃或4℃保存备用;

三.粪便以及天然孔排泄物:采集后一般现用PBS/生理盐水溶解,充分混匀,800-1000rmp x 5min分离,取上清,-20℃或4℃保存备用;

四.活检组织一般进行穿刺检测,zui常见的就是肝活检,像病毒性肝炎、脂肪肝、各种类型的肝硬化等进行活检简单方便、准确。

三、表达产物的检测

(一)真核表达产物

1、   细胞上清(分泌性蛋白)

1.2、贴壁细胞或半贴壁,直接将细胞培养上清吸出,10000rmp x10min, 取上清,-20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;

1.2、不贴壁细胞,将培养基和细胞转移至10ml离心管,500-800rmp x10min,吸取上清至另一10ml离心管中,10000rmp x10min, -20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;

2、   细胞裂解物(非分泌性蛋白)

2.1、贴壁细胞或半贴壁,直接将细胞培养上清吸出,然后用001M PBS(pH 7.4)将细胞吹下至10ml离心管,500-800rmp x10min,弃上清,沉淀转移至1.5ml离心管中, DDW重悬,置冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解,10000rmp x10min,取上清,-20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;

2.2、不贴壁细胞,将培养基和细胞转移至10ml离心管,500-800rmp x10min,弃上清,沉淀移至另一10ml离心管中,0.01M PBS(pH 7.4)重悬,500-800rmp x10min,弃上清,沉淀移至1.5ml离心管中, DDW重悬,置冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解,10000rmp x10min,取上清, -20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;

(二)原核(大肠杆菌表达系统)表达产物

1、表达上清(非融合性蛋白)

直接将培养物和上清吸出,10000rmp x10min, 取上清,-20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;

2、菌体裂解物(融合性蛋白)

直接将培养物和上清吸出,10000rmp x10min,弃上清,沉淀用PBS洗一遍,500-800rmp x10min,弃上清,DDW重悬沉淀,冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解,10000rmp x10min,取上清,-20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;

 

注意事项

1.试剂准备:所有试剂都必须在使用前达到室温,使用后请立即按照说明书要求保存。实验操作中必须使用一次性吸头,避免交叉污染。

2.加样:加样时,要控制加样速度,避免*孔与zui后一孔之见的时间间隔过大,否则将会导致不同的预孵育时间,从而影响实验的准确性以及重复性;一般加样时间控制在10分钟内,如果样本数量过多,可使用多道移液器。

3.孵育:样品要在密闭的容器内进行孵育,严格按照说明书上规定的孵育时间和温度进行。

4.洗涤:洗涤过程中反应孔中的残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干,同时要消除板底残留的液体和手指痕迹,避免影响zui后的酶标仪读数。

5.反应时间的控制:加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如,10分钟左右),如果颜色较深,请提前加入终止液终止反应。

6.建议实验前预测样品含量,如样品浓度过高,应对样品进行稀释,计算结果时乘以相应的稀释倍数。

7.建议使用本试剂盒时先做预实验(即先做标准曲线,试用几个标本),如果对本试剂盒有任何疑问,可和所购经销商,如果因运输过程导致试剂盒失效,可要求调换,但概不承担产品本身以外的任何损失。

 

操作步骤

1.          取出试剂盒,于室温(20-25℃)放置15-30分钟。实验过程应在室温(20-25℃)内进行。

2.          取出酶标板,按照标准品的次序分别加入50μl的标准品溶液于空白微孔中。

3.          空白微孔中加入50μl的样品,空白对照加入50μl的蒸馏水;

4.          在样品孔中加入10μl的生物素;(不含空白对照孔,切忌:生物素只加样品孔!)

5.          在各孔中加入100μl的酶标记溶液;(不含空白对照孔)

6.          将酶标板用封口胶密封后,37℃孵育反应 1小时;(在孵育箱中保持稳定的温度与湿度)

7.          充分清洗酶标板3-5次,保持各孔有充足的水压;(浓缩洗涤液以1:100的比例与蒸馏水稀释)

8.          酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干;

9.          各孔加入显色剂A、B液各50μl;(不含空白对照孔)

10.       20-25℃下避光反应15分钟;

11.       各孔加入50μl终止液,终止反应;

结果判断

1.          30分钟内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值;

2.          以OD值为纵坐标,以标准品的浓度为横坐标,绘制曲线图;

3.          根据样品的OD值查找对应的浓度范围;

4.          敏感度:0.1 ng/ml

电话:
13788993509
13788995069
021-64133189
传真:
021-64129208
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