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如何选择Z佳的全血DNA、RNA提取方法?点击次数:1541 发布时间:2010-08-03

                           如何选择zui佳的全血DNA、RNA提取方法?
 

从全血中提取DNA和RNA应该说是zui基本的工作了,提取的DNA和RNA质量的好坏直接影响了下游的实验和分析,可供选择的方法非常多,乱花渐欲迷人眼,如何选择的方法,成了很多人实验开始前zui难以抉择的事情。我们从两个方面,层层剥茧,分析zui佳的实验方法。
 
1、  全血的采集保存和DNA的提取
I.       用含抗凝剂的采血管进行采血,抗凝剂一般有EDTA和肝素,EDTA更好一些,不会影响下游的反应,如果没有采血管,也可以自己添加抗凝剂EDTA,提前准备0.04M的EDTA溶液,每5ml的血液中加入0.4ml配好的EDTA溶液,颠倒混匀即可。保存于-20℃至-80℃,一般2-3年内均可以提取,保存时间越短,提取的质量越高,在2个月内提取。
II.       DNA提取方法的选择:全血提取试剂盒一般有离心柱和溶液型两种(比如Qiagen、Promega、Bioteke;摒弃酚氯仿手提的方法,时间长毒性大),原理及步骤基本相同。虽然各公司推出了N多型号,让人不知如何去选择,但从原理和操作步骤看,基本就是离心柱和溶液型两种。一般来说,离心柱(DP1801)的提取纯度高一些,但是处理量小(0.1-1ml)、得率略低;溶液型(DP2101或DP2201)的提取量大(1-10ml)得率也高于离心柱。医院的血液标本一般在2ml以上,一般选择溶液型的方法提取.在说到国产和进口差别的时候,很多人以为进口一定比国产的好,我们觉得没有,只有更好!在不断的进行试验优化之后,全血基因组DNA提取试剂盒DP2101或DP2201开创了第三代技术,不需要蛋白酶K消化,进口的都是要借助蛋白酶K的啊!DP2101或DP2201减少了蛋白酶K现配现用的麻烦和消化的时间,而且提取量和稳定性更好。
III.     非抗凝血(凝固血)能否提取?答案是肯定的,而且一点都不麻烦,提取效果和抗凝血没有差别!
2、  全血RNA如何提取
I.       全血RNA提取过程哪些是RNA降解的因素?
全血中RNA酶是非常丰富的,RNA在没有保护的状态下很容易降解!哪些是状态RNA不受保护呢,比如红细胞裂解液裂解红细胞的过程,红细胞裂解液是低浓度的平衡盐溶液,没有抑制RNase的成份,这时候RNA不受保护;DNA酶消化的时候RNA也不受保护,这个时候也没有抑制RNase的成份。
II.    什么样的提取方法更好?
我们在选择方法的时候要倾向于对RNA全程有保护的方法!一般的方法都是先用红细胞裂解液裂解红细胞,然后从白细胞提取核酸,还要经过DNA酶的消化去除DNA,这种并不是的方法,过程中有很多RNA降解的因素。所以直接裂解法是的方法,将采集的血液迅速加入3倍体积的裂解液RLS——RP4001血液(液体样本)总RNA快速提取试剂盒(离心柱型)的裂解液,迅速颠倒混匀。裂解液RLS含有强烈的蛋白变性剂,能迅速变性蛋白,是RNase变性,不能对RNA降解。裂解后的混合液还可以用来运输,以避免RNA降解,这个方法成为博奥生物制作表达谱芯片RNA运输和提取的推荐方法
环境微生物DNA提取方法的突破
农药、除草剂、各种污染物、人工合成物等异生物质,对环境和土壤微生物的多样性、种群变化产生明显影响;转基因作物是否发生土壤基因转移的检测,转基因作物的安全性评价等
方面的研究,都需要准确的提取高质量的DNA进行检测!
 
土壤中可培养的微生物可能不及所有微生物总数的0.3%,常规提取DNA的方法很难提取到DNA,很难把土壤中的腐殖酸去除干净,而微量的腐殖酸就可能导致PCR失败。
 
目前上商用的试剂盒虽然能提取到土壤中微生物的DNA,但由于破碎方法采用玻璃珠或者钢珠破碎,导致基因组断裂严重,影响DNA质量;第二,由于必须购买破碎的破碎机或振荡器,增加其使用成本;第三,其试剂盒为了保证DNA纯度,采用了包括玻璃奶、离心吸附柱串联的纯化方式,导致了DNA大量的损失,得率很低,很难真正反映出土壤中微生物的多样性。
土壤基因组DNA快速提取试剂盒(DP4001)采用创新技术,摒弃了机械破碎细胞的方法,采用酶法破碎,保证了基因组的完整性,摒弃了玻璃奶、离心吸附柱串联纯化DNA的方式,极大的提高了DNA的得率,几乎土壤中所有的微生物DNA都能提取出来,能真正反映土壤中微生物的多样性!
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