地高辛配基随机标记DNA探针

1．标记DNA探针 每次标准的反应可标记10ng至3线性的DNA，也可标记更大量的DNA，但所有的成分和体积要相应增加。

（1）DNA探针热变性，煮沸10min，迅速冷却于冰/乙醇中5min以上，待用。

（2）取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上，加下列及试剂：

新鲜变性的DNA 1-3

六聚核苷酸混合物 2（管5）

dNTP标记用混合底物 2（管6）

加无菌重蒸水至 19

DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow） 1（管7）

（3）在37℃保温至少60min，可到20h。

（4）煮沸5min，终止反应。

（5）15000rpm离心30s，置于冰上待用。

2．预杂交 按100cm2膜用20～40ml预杂交溶液，预杂交时使溶液处于流动状态。

预杂交液组成：5㗓SC

0.5%（W/V）封阻试剂（管11）

0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠

0.02%（W/V）SDS

膜放入塑料袋，灌入预杂交液，排除气体后密封，在65℃预杂交过夜。

3．杂交 按100cm2膜用2.5ml杂交液，杂交时偶尔摇动杂交袋，使里面的溶液重新分配。

杂交液组成： 50%甲酰胺（V/V）

5%（W/V）封阻试剂

5㗓SC

0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠

0．02%（W/V）SDS

新变性标记DNA（150ng/ml）

杂交液取代预杂交液，替换间膜不能干，成功地替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42℃杂交过夜（16～20h）。

4．洗膜 按100cm2膜用250ml洗膜液计算。

（1）在室温下用2㗓SC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。

（2）在65℃条件下用0.1㗓SC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。

（3）在室温下用2㗓SC溶液漂洗1次。

5．免疫测定

（1）配制溶液

缓冲液1：Tris-HCl（100mmol/L）;NaCl（150mmol/L）pH7.5（20℃）

缓冲液2：0.5%（W/V）封阻试剂（管11）,配制于缓冲液1中（封阻试剂不会快速溶解,因此应预早1h前配制此溶液,将试剂溶于50～70℃,此溶液保持混浊）。

缓冲液3：Tris-HCI（100mmol/L）;NaCI（100mmol/L）;MgCI2（500mmol/L）pH9.5（20℃）。

缓冲液4：Tris-HCl（10mmol/l）;EDTA（1mmol/L）;pH8.0（20℃）

显色溶液：新鲜配制，在10ml缓冲液3中，加45NBT溶液（管9）和35X-磷酸盐缓冲液（管10）。

2． 显色过程

A．膜在缓冲液1中短暂洗涤（1min）。

B．在100ml缓冲2中保温30min。

C．再用缓冲液1短暂洗涤。