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抗体使用常见问题解答点击次数:1270 发布时间:2010-01-08

 

使用抗体常见问题解答

1
、如何选择合适的一抗?

请先确定您要检测的种属和使用的实验方法,然后查找相关产品,根据说明书上描述的“适用种属和实验方法”来确定合适的抗体。如果说明书中有明确您要检测的种属和实验方法均经过检测,则您可以放心地购买该产品。
2、如何选择合适的二抗?

二抗的选择原则:

  • 针对一抗来源的二抗(比如一抗是小鼠来源的,二抗就要是抗小鼠的)
  • 针对一抗Ig亚型的(比如一抗是IgM,二抗就要是抗IgM的抗体)
  • 为了增加特异性、降低背景:可以选择Fab段的抗体(去除Fc段的)、经过标本来源种属血清吸附的的二抗
  • 查看二抗的说明书,选择经过验证可以用于相应实验方法的二抗

3 如何选择同型对照?

同型对照的主要目的是确定一抗的结合是特异性的,而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。同型对照要与一抗的来源、Ig分型和标记完全一致。例如:一抗是FITC标记,其抗体分型是小鼠的IgG1,则同型对照要选择是FITC标记的小鼠的IgG1。

多抗的同型对照:

绝大部分的同型对照产品都是单克隆抗体,因此不适用于作为多克隆抗体的对照(因为多抗含有多种IgG的亚型)。
4、如何选择阳性对照?

阳性对照的使用是一个实验中确定抗体及检测系统是否正常工作的依据,也是确定待测标本中是否存在待测蛋白的一个依据!尤其是检测的标本是不确定是否有待测蛋白表达时。因此当实验没有阳性结果出现时,的选择是实验合适的阳性对照。

说明书上都有推荐的阳性对照。但是如果说明书上没有推荐时,请参考以下条款:

  • 看看说明书中是否有Abreviews。任何被其他客户成功检测的组织、细胞或者裂解物均可以作为合适的阳性对照!
  • 根据说明书上的Swiss-Prot 或 Omnigene 数据库来查找。这些数据库经常会列出该蛋白表达的组织,这也可以作为合适的阳性对照!
  • 查查该蛋白的GeneCards 吧,这里通常会有蛋白在不同组织的表达水平。
  • 如果上述方法还是不能找到合适的阳性对照,推荐您去PubMed 查查发表文章,看看有无文章报道该蛋白表达的细胞和组织

5、如何确定一抗的稀释比例?

如果说明书中有推荐的稀释比例,请按照该稀释比例进行实验。但是由于标本类型、实验条件、操作环境等各种因素的影响,推荐浓度仅作为参考。实验者需要在推荐浓度周围进行多个浓度梯度的实验,从中发现*的稀释比例。

如果说明书没有推荐稀释比例,仅注明“Use at an assay dependent dilution”,就需要做大量的预实验来摸索*的比例了。下表列出的纯化抗体抗体用于不同实验方法时常用的工作浓度,可以作为预实验的参考。未纯化的抗体一般在说明书中不会标明抗体的浓度,因为大部分全抗血清、培养上清或腹水形式的产品浓度都是没有经过测定的。如果未纯化抗体产品的说明书中没有标明其中特异性抗体的浓度,实验者可以参考下表中“估计浓度”确定各种实验稀释比例。

请记住,下表中的各种稀释比例和工作浓度仅仅是作为一个起始点,需要根据试验结果来进行适当的调整。以此起点作一系列的浓度,从中确定*的工作浓度和稀释比例!

 
组织培养上清
腹水
全抗血清
纯化抗体
WB / dot blot
1/100
1/1000
1/500
1 ug/ml
IHC / ICC
neat - 1/10
1/100
1/50 - 1/100
5 ug/ml
EIA / ELISA
1/1000
1/10000
1/5000
0.1 ug/ml
FC
1/100
1/1000
1/500
1 ug/ml
IP
 
1/100
1/50-1/100
1 - 10 ug/ml
Concentration estimate
1 - 3 mg/ml
5 - 10 mg/ml
1 - 10 mg/ml
 

6、如何确定适用于某种特定抗体的抗原修复方法?

有些抗体对抗原修复方式有特别要求的,一般在其说明书中都会有明确的标注和推荐。但是很多抗体并没有一个特别的推荐,就需要实验者自己来进行优化和摸索了。
7、为何实际检测到的WB条带与预期的有所区别?

WB是根据蛋白质的大小来分离蛋白的,通常小分子量蛋白在凝胶中的迁移速度要快。但是迁移率也是受到其他因素影响的,这就造成了实际检测到的条带与预期条带的不一致。主要有以下几种常见因素:

  • 翻译后修饰-比如磷酸化、糖基化等,这些修饰会增加蛋白质的分子量
  • 翻译后剪切- 比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的,在执行功能时需要进行剪切成活化的形式,如pro-caspases
  • 不同剪切体 – 有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方式,每个剪切方式得到的蛋白大小都是不同的
  • 相对电荷(Relative charge – 氨基酸的组成(charged vs non-charged)
  • 多聚体-如二聚体或三聚体。这些多聚体的形式通常会抵制WB时所做的还原条件,因此造成检测的条带偏大。

 

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