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罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序点击次数:2532 发布时间:2009-12-31

罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序

货号:11684817910,In Situ Cell Death Detection Kit, POD,价格:5266.8

一、 原理:

TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素(fluorescein)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端,并与连接辣根过氧化酶(HRP,horse-radish peroxidase)的荧光素抗体特异性结合,后者又与HRP底物二氨基联苯胺(DAB)反应产生很强的颜色反应(呈深棕色),特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂,因而没有3‘-OH形成,很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价,以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、 器材与试剂

器材:光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒(塑料饭盒与纱布)、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等;

试剂:试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HRP;自备试剂:PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇(100、95、90、80、70%)、DAB工作液(临用前配制,5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS)、Proteinase K工作液(10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl, pH 7.4-8)或细胞通透液(0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate,临用前配制)、苏木素或甲基绿、DNase 1(3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl,pH 7.5, 10 mM MgCl2,1 mg/ml BSA)等。

三、 实验步骤

操作流程图:制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。

具体操作步骤:

1. 用二甲苯浸洗2次,每次5min;

2. 用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min;

3. PBS漂洗2次;

4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min;

5. PBS漂洗2次;

6. 制备TUNEL反应混合液,处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液,阳性对照组先加入100μl DNase 1,反应在15~25℃×10min,后面步骤同处理组。

7. 玻片干后,加50μl TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液)于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。

8. PBS漂洗3次;

9. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm,检测波长为515~565nm);

10. 玻片干后加50μl converter-POD于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。

11. PBS漂洗3次;

12. 在组织处加50~100μlDAB底物,反应15~25℃×10min;

13. PBS漂洗3次;

14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染,几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

15. 加一滴PBS或甘油在视野下,用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200~500个细胞)并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断(未染色细胞变小,胞膜完整但出现发泡现象,晚期出现凋亡小体,贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落;而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化,核膜裂解,染色质分割成块状/凋亡小体)

四、 注意事项

1. 进行PBS 清洗时,每次清洗5 min。

2. PBS清洗后,为了各种反应的有效进行,请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。

3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后,请盖上盖玻片或保鲜膜,或在湿盒中进行,这样可以使反应液均匀分布于样本整体,又可以防止反应液干燥造成实验失败。

4. TUNEL反应液临用前配制,短时间在冰上保存。不宜长期保存,长期保存会导酶活性的失活。

5. 如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色,则不可使用,需重新配制。

6. 用甲基绿(Methyl Green)染液(3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0)染色后,请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净(100%乙醇)、脱水(二甲苯)透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80~90%的乙醇洗净时,甲基绿比较容易脱色,注意快速进行脱水操作。

7. 荧光素标记的dUTP液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物,可通过吸入、口服等途径进入机体,注意防护。

8. 试剂保存;未打开的试剂盒贮存在-20℃(-15~25℃);converter -POD液一旦解冻,以后就保存在4℃(2~8℃)下,至少在6 m内稳定,避免再次冻存;TUNEL反应液临用前配好后,放至冰上直至使用。

9. 结果分析时注意:在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断,从而引起假阳性结果;而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全,以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应,进而产生假阴性结果。

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