Western Blotting的常见问题及解决方法
问 题 | 出现的原因 | 解决方法 |
1. 胶片上存在反转印象 (如:亮的条带.黑的背景) | HRP的浓度过高 | 稀释HRP至少10倍 |
2. 膜上有黄色或棕色的沉积 | HRP的浓度过高 | 稀释HRP至少10倍 |
3. 在暗室中条带过于明亮 | HRP的浓度过高 | 稀释HRP至少10倍 |
4. 条带的发光时间持续了至 少8小时 | HRP的浓度过高 | 稀释HRP至少10倍 |
5. 信号太弱或没有 | 1.太多的HRP积聚导致信号快速的消退 2.抗原或抗体的浓度不够 3.转印不成功 4.HRP或其他底物的效价降低 | 1.稀释HRP至少10倍 2.增加其浓度 3.寻找合适的转移方法和条件 4.选择其他的合适底物 |
6. 背景高 | 1.HRP浓度过高 2.封闭无效 3.不适合的封闭试剂 4.洗涤不充分和洗涤液的量 5.胶片曝光过度 6.抗原或抗体的浓度太高 | 1.稀释HRP至少10倍 2.寻找合适的封闭方法 3.选用其他的封闭试剂 4.增加洗涤的时间,次数5.减少曝光时间 6.稀释抗原或抗体 |
7. 蛋白质条带上 有空泡影像 | 1.蛋白质没有被充分转印 2.膜没有预先浸湿 3.在胶片和膜之间有气泡 | 1.寻找合适的转移方法和条件 2.在转印前充分浸湿 3.在暴光之前赶走气泡 |
8. 胶片上背景弥散 | HRP标记的抗体出现了积聚 | 用0.2μL的滤膜过滤HRP标记的抗体 |
9. 无特异性条带 | 1.HRP浓度过高 2.SDS促使非特异蛋白质条带黏附在目的蛋白质条带上 | 1.稀释HRP至少10倍 2.在操作过程中不要加SDS |