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PCR疑难解决办法总结点击次数:2984 发布时间:2012-03-15

                                  PCR疑难解决办法总结

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问题1:不出现扩增条带引物:引物质量是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。对策为:选定合适的引物合成单位;引物的浓度不仅要看OD值,用引物原液做琼脂糖凝胶电泳,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应与引物合成单位协商解决,如一条引物亮度高,一条引物亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度;引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏而导致变质降解失效;引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。
问题2:出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带出现的原因:一是引物与靶序列不完全互补,或引物聚合形成二聚体;二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。对策为:必要时重新设计引物;减低酶量或调换另一来源的酶;降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数;适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性,65左右退火与延伸
问题3:出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。可能由于Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多,GC含量过高引起。对策为:适当降低Mg2+浓度;增加模板量;减少循环次数;加入添加剂甘油或Qiagen公司的Q-solution
问题4:污染的监测——对照试验 1.阳性对照:应设有阳性对照,它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下 2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照,被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照;试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNARNA进行PCR扩增,以监测试剂是否污染。 3.重复性试验 4.选择不同区域的引物进行PCR扩增
问题5:污染的处理(一)环境污染 1.稀酸处理法 2.紫外照射(UV)(二)反应液污染,可采用下列方法之一处理: 1DNase I 2.内切酶法 3.紫外照射法 4Gama射线辐射法(三)尿嘧啶糖苷酶(UNG)由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好,而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右,因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。(四)固相捕获法用于去除标本中污染的核酸和杂质。(五)RS-PCR(RNA-specificPCR) 也称为链特异性PCR,主要指用于RNA模板的特异性PCR法,该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。(六)抗污染引物法该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点,这一区域只存在于完整的原病毒中。如果重组质粒污染了标本,就不能扩增出任何条带,即使出现了扩增带,其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增,因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的,该法试用于环状靶分子系列。
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