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PCR疑难解决办法总结
点击次数:3749 更新时间:2012-03-15
PCR疑难解决办法总结
www.runwelltac.com
问题
1:
不出现扩增条带
引物:引物质量是
PCR
失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。对策为:
①
选定合适的引物合成单位;
②
引物的浓度不仅要看
OD
值,用引物原液做
琼脂糖凝胶
电泳,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做
PCR
有可能失败,应与引物合成单位协商解决,如一条引物亮度高,一条引物亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度;
③
引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏而导致变质降解失效;
④
引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。
Mg2+
浓度:
Mg2+
离子浓度对
PCR
扩增效率影响很大,浓度过高可降低扩增的特异性,浓度过低则影响
PCR
扩增
产量甚至使
PCR
扩增失败而不出扩增条带。
靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使
引物
与模板失去互补序列,其
PCR
扩增是不会成功的。
问题
2:
出现非特异性扩增带
PCR
扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带出现的原因:一是引物与靶序列不*互补,或引物聚合形成二聚体;二是
Mg2+
离子浓度过高、退火温度过低,及
PCR
循环次数过多有关。
其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。对策为:必要时重新设计引物;减低酶量或调换另一来源的酶;降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数;适当提高退火温度或采用二温度点法
(93
℃
变性,
65
℃
左右退火与延伸
)
。
问题
3:
出现片状拖带或涂抹带
PCR
扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。可能由于
Mg2+
浓度过高,退火温度过低,循环次数过多,
GC
含量过高引起。对策为:适当降低
Mg2+
浓度;增加模板量;减少循环次数;加入添加剂甘油或
Qiagen
公司的
Q-solution
。
问题
4:
污染的监测
——
对照试验
1.
阳性对照:应设有阳性对照,它是
PCR
反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高
(100
个拷贝以下
)
。
2.
阴性对照:每次
PCR
实验
务必做阴性对照。它包括
①
标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照,被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照;
②
试剂
对照:在
PCR
试剂中不加模板
DNA
或
RNA
进行
PCR
扩增,以监测试剂是否污染。
3.
重复性试验
4.
选择不同区域的引物进行
PCR
扩增
问题
5:
污染的处理
(一)环境污染
1
.稀酸处理法
2
.紫外照射
(UV)
法
(二)反应液污染,可采用下列方法之一处理:
1
.
DNase I
法
2
.内切酶法
3
.紫外照射法
4
.
Gama
射线辐射法
(三)尿嘧啶糖苷酶
(UNG)
法
由于
UV
照射的去污染作用对
500bp
以下的片段效果不好,而临床用于检测的
PCR
扩增片段通常为
300bp
左右,因此
UNG
的预防作用日益受到重视和肯定。
(四)固相捕获法
用于去除标本中污染的核酸和杂质。
(五)
RS-PCR
法
(RNA-specificPCR)
也称为链特异性
PCR
,主要指用于
RNA
模板的特异性
PCR
法,该法可明显降低假阳性而不影响
PCR
的敏感性。
(六)抗污染引物法
该对引物扩增时通过病毒
DNA
克隆如入质粒的位点,这一区域只存在于完整的原病毒中。如果重组质粒污染了标本,就不能扩增出任何条带,即使出现了扩增带,其大小也与预期的不同。只有原病毒
DNA
才能被引物扩增,因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的,该法试用于环状靶分子系列。
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