技术文章

间接免疫荧光法-检测细胞内抗原点击次数:3650 发布时间:2012-01-12

                                    间接免疫荧光法-检测细胞内抗原

       细胞内抗原的检测过程与细胞表面抗原检测过程基本一致,只是在与一抗孵育前,需要预先对细胞用非离子去污剂进行透化处理。www.biomart.cn/runwell/index.htm

操作方法www.runwelltac.com
1. 取已固定好的细胞爬片或甩片或经过预处理的组织切片(石蜡或冰冻切片);
2. 用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的细胞2min(室温),有些标本可能需要长达15min,时间视抗原而定;
3. 余下步骤接上述“细胞表面抗原的检测-间接免疫荧光法”步骤(2);
 
注意事项
1. 在使用前,一抗二抗均应测试其合适的稀释度。
2. 多聚甲醛的固定是不稳定的,标本经多聚甲醛固定后,应再用去污剂处理,如果标本在水溶液中浸泡的时间过长,则会使交联结构解体。因此,应避免固定后的标本在水溶液中浸泡的时间过长。
3. 信号微弱的解决方法:
① 提高一抗和二抗的浓度以增强敏感性 ,这必须测试各种浓度抗体的滴度;
② 延长一抗和二抗的孵育时间。由于细胞染色时抗原吸附在固相载体上,抗原抗体结合时间较在溶液中长。孵育时间可因实验设计作适当调整,但少于20min抗体和抗原几乎不能有效结合。在以上两点中,应摸索出一个zui佳条件以产生有效信号且保持良好的背景。这就需要反复试验,因为每组抗体和抗原的情况会有所不同;
③ 改变检测方法,用共聚焦显微镜观察,可提高敏感性。
4. 背景不好的解决方法
细胞样本进行荧光染色时,背景问题主要来自两个方面,即非特异性染色和特异性交叉反应。
① 非特异性吸附:非特异性吸附背景问题的产生与抗原抗体的特异性结合无关。即一抗或二抗与样品相互作用而发生吸附,而不是与抗原发生特异性结合。
*将所有抗体溶液或含蛋白的检测试剂用100,000′g离心30min以去除蛋白聚合物。
*滴定一抗和所用的检测试剂,以确定能够产生合适信号的zui低浓度。
*固定后,用饱和量并不被检测试剂结合的非特异性抗体封闭样品,有效的封闭液包括5%的与标记二抗来源相同的同种血清、3%的BSA和3%的脱脂奶粉。
*用上述封闭液稀释抗体和检测试剂。
*固定后,在所有的缓冲液及洗涤液中加入2%吐温-20。
*缩短一抗或标记试剂的孵育时间。
*充分洗涤(延长洗涤时间,重复次数)。
*改变检测方法。
② 特异性背景:造成特异性背景问题的原因有三种因素,即污染抗体所致假阳性、交叉反应和样品中含有能与Ig结合的蛋白质。
*如用多克隆抗体,应滴定抗体(假阳性)。
*如用多克隆抗体,亲和纯化特异性抗体(假阳性)。
*如用多克隆抗体,用适当的丙酮肝脏粉吸收以阻抑假阳性。
*换用其他抗体(交叉反应及假阳性)。www.runwelltac.com
电话:
13788993509
13788995069
021-64133189
传真:
021-64129208
陈小姐点击这里给我发消息
徐小姐点击这里给我发消息
朱小姐点击这里给我发消息
 
安全联盟站长平台

化工仪器网

推荐收藏该企业网站