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蛋白质的沉淀方法及常见沉淀剂点击次数:18862 发布时间:2011-10-18

                                 蛋白质的沉淀方法及常见沉淀剂

蛋白质沉淀的概念:www.runwelltac.com
蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀(precipitation),变性蛋白质一般易于沉淀,但也可不变性而使蛋白质沉淀,在一定条件下,变性的蛋白质也可不发生沉淀。

定性分析:
蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素,即颗粒表面的水化层和电荷。若无外加条件,不致互相凝集。然而除掉这两个稳定因素(如调节溶液pH至等电点和加入脱水剂)蛋白质便容易凝集析出。如将蛋白质溶液pH调节到等电点,蛋白质分子呈等电状态,虽然分子间同性电荷相互排斥作用消失了。但是还有水化膜起保护作用,一般不致于发生凝聚作用,如果这时再加入某种脱水剂,除去蛋白质分子的水化膜,则蛋白质分子就会互相凝聚而析出沉淀;反之,若先使蛋白质脱水,然后再调节pH到等电点,也同样可使蛋白质沉淀析出。

沉淀方法:
1.盐析法——多用于各种蛋白质和的分离纯化

在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出,这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同,故可用于对混和蛋白质组分的分离。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白,饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来,盐析沉淀的蛋白质,经透析除盐,仍保证蛋白质的活性。调节蛋白质溶液的pH至等电点后,再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。盐析法分为两类,*类叫Ks分段盐析法,在一定PH和温度下通过改变离子强度实现,用于早期的粗提液;第二种叫b分段盐析法,在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现,用于后期进一步分离纯化和结晶。影响盐析的因素包括:蛋白质浓度、离子强度和类型、PH值、温度等。针对温度这一条,需要强调:在低离子强度或纯水中,蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下,蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下,蛋白质对盐析温度无特殊要求,可在室温下进行,只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。
使用硫酸铵沉淀蛋白需要注意:硫酸铵中常含有少量的重金属离子,对蛋白质巯基有敏感作用,使用前必须用H2S处理:将硫酸铵配成浓溶液,通入H2S饱和,放置过夜,用滤纸除去重金属离子,浓缩结晶,100℃烘干后使用。另外,高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性(PH=5.0左右),使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。

2.有机溶剂沉淀法——多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化;

有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数,导致具有表面水层的生物大分子脱水,相互聚集,zui后析出。该法优点在于:1)分辨能力比盐析法高,即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀;2)沉淀不用脱盐,过滤较为容易;3)在生化制备中应用比盐析法广泛。但是,在常温下,有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此。因此,操作要求在低温下进行。有机溶剂的选择首先是能和水混溶,使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮,还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。

3.等电点沉淀法——此法单独应用较少,多与其它方法结合使用;


两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度zui低,不同的两性电解质具有不同的等电点,以此为基础可进行分离。如工业上生产胰岛素时,在粗提液中先调PH8.0去除碱性蛋白质,再调PH3.0去除酸性蛋白质。利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性,不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后,等电点会发生偏移,故溶液中含有金属离子时,必须注意调整PH值。等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用,以提高其沉淀能力。
 

附:沉淀血浆中各种溶剂以及去蛋白的效果<各种蛋白沉淀剂作用的比较>

名称

上清液

0.5ml血浆中不同沉淀剂使蛋白沉淀的%

PH值

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0
10%三氯醋酸 1.4-2.0

99.7

99.3

99.6

99.5

99.5

99.7

99.8

99.8

99.8

6%高氯酸 <1.5

35.4

98.3

98.9

99.1

99.1

99.2

99.2

99.1

99.0

5%磷酸 1.6-2.7

39.8

95.7

98.1

98.3

98.3

98.5

98.4

98.2

98.1

乙腈 8.5-9.5

13.4

14.8

45.8

88.1

97.2

99.4

99.7

99.8

99.8

丙酮 9-10

1.5

7.4

33.6

71.0

96.2

99.1

99.4

99.2

99.1

甲醇 8.5-9.5

17.6

17.4

32.2

41.3

73.4

97.9

98.7

98.9

99.2

乙醇 9-10

10.1

11.4

41.7

74.8

91.4

96.3

98.3

99.1

99.3

Na2WO4-H2SO4 2.2-3.9

3.3

35.4

98.6

99.7

99.7

99.9

99.8

99.9

100

CuSO4-Na2WO4 5.7-7.2

36.5

56.1

78.1

87.1

97.5

99.8

99.9

100

100

ZnSO4-Ba(OH)2 6.6-8.3

45.6

80.7

93.5

89.2

93.3

97.0

99.3

99.6

99.8

(NH4)2SO4(饱和)

7.0-7.7

21.3

24.0

41.0

47.4

53.4

73.2

98.3

——

——

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