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细胞因子生物学活性检测和浓度测定的分析方法点击次数:171 发布时间:2021-07-23

  细胞因子已广泛应用于临床的已有EPO、IFN-α、G-CSF、GM-CSF以及试用于临床的白细胞介素等。为了研究细胞因子在生理系统的作用以及了解细胞因子产品用于临床治疗的效果,进行细胞因子的检测就很重要,而且用于临床诊断的细胞因子分析方法必须适用于常规操作。
 
  细胞因子生物学活性检测和浓度测定的分析方法主要有以下几类:
 
  1.1 生物分析法
 
  生物分析法方便,敏感性高,但所有细胞系有可能受几种细胞因子的影响,特异性则较差。又由于可溶性细胞因子受体等抑制剂的存在,使生物分析法可能低估细胞因子的活性。常用的方法有2种:(1)依赖性细胞株增敏实验。一些肿瘤细胞株依赖于细胞因子方能在体外增殖,如TF-1细胞株依赖于GM-CSF和IL-3[4,5] ,CTLL细胞株依赖于IL-2,TTD-1细胞株依赖于IL-6等 [4] 。可利用这些依赖株检测相应的细胞因子。但是,并非所有细胞因子均有相应的依赖株,因此限制了此法的应用。(2)功能检测实验。利用一些细胞因子的功能特性而建立相应的活性测定方法。如IFN抗病毒实验和tnf对L 929 细胞的杀伤作用等[4] 。此外,生物分析法还有骨髓集落形成实验,细胞毒或细胞抑制实验,次级分子分泌的诱导,化学趋化和细胞因子分泌性的抑制实验等。
 
  1.2 免疫分析法
 
  利用抗原机体反应的原理,制备出抗细胞因子的单抗或多抗,可进行细胞因子的免疫检测,它包括放免实验(RIA)和酶联免疫吸附实验(ELISA)等。其优点是高特异性、高灵敏度、操作简便。缺点是不能证明被测细胞因子是否为具有完整生物活性结构的蛋白质而非变性蛋白质。
 
  1.3 CKmRNA的测定
 
  (1)分子杂交实验:首先制备出细胞因子的基因探针,通过分子杂交检测细胞内CKmRNA的表达。(2)逆转录PCR(RT-PCR)法技术:可快速、灵敏地检测表达很低的CKmRNA,并可同时测定同一样本中多种CKmRNA,操作过程包括细胞因子产生细胞的RNA提取,mRNA经逆转录合成cDNA,以cDNA为模板,在细胞因子引物的引导下,即可进行PCR扩增。根据定量CKmRNA方法和原理的不同,可分为半定量PCR法,竞争性定量PCR法,内参标定量PCR法,HPLC-PCR法和酶联免疫定量PCR法 [6] 。目前市售的商品试剂盒已能用于大多数细胞因子的检测,但因其价格昂贵而阻碍了其广泛使用。同时,人细胞因子的测定仍存在许多问题,检测方法选择不当可能得到不一致的结果,有时有必要选择一个以上的检测方法测定细胞因子。
 
  2.灵敏度
 
  细胞因子具有很强的生物学活性,其生物分析法的灵敏度高。然而,在测定血浆中细胞因子正常浓度时,难以确定免疫分析法令人满意的灵敏度。不同细胞因子的参考值变化很大,难以定义其参考值范围。如Damas等在研究细胞因子与败血症时,使用两步免疫放射测定实验(IRˉMA)测定IL-6(灵敏度:5ng/ml)一步IRMA法测定TNF-α(灵敏度:5ng/L)和IL-1β(灵敏度:4ng/L),在正常血清中未测得上述细胞因子。而Riikonen等使用具有相似检测限的RIA法,在20例健康儿童中,IL-1β的平均浓度为12.1ng/L,IL-6的平均浓度为83ng/L;在71例健康儿童中,TNF-α的平均浓度为40±2ng/L。由此可见,不同的免疫分析方法之间存在较大的差异,其灵敏度变化可能是由于其准确度和特异性的不同而引起。
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