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蛋白酶K的配置标准及保存方法点击次数:376 发布时间:2021-06-25

  蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定,还具有降解天然蛋白质的能力,因而它应用很广泛,包括制备脉冲电泳的染色体 DNA,蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50—100μg/ml。在较广的pH范围内(pH 4-12.5)均有活性。
 
  推荐反应缓冲液:50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。
 
  蛋白酶K配制标准:20mg/ml蛋白酶K配制标准(proteinase K):将200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中,轻轻摇动,直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml,然后分装成小份贮存于-20℃。
 
  蛋白酶K的保存:保存在-20℃冰箱里,避免反复冻融,有效保证12月。
 
  孵育温度为55至65℃,理想孵育温度为58℃,孵育时间为15分钟至48小时;理想孵育时间为2小时。
 
  作用:蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理,它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用,以增加探针与靶核酸结合的机会,提高杂交信号.但蛋白酶K的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时,都会对细胞的结构有一定的破坏,导致组织切片的脱落,细胞核 的消失,从而影响杂交结果。EDTA缓冲液可以替代蛋白酶K的作用,解决上述出现的问题,并能达到理想的染色效果。
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