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免疫组化技术要点和常见问题点击次数:2489 发布时间:2010-12-27

                          免疫组化技术要点和常见问题

在免疫组化过程中,为了更好的说明问题和查找原因,设置阳性对照片(已知的高表达相应抗原的组织)和阴性对照组织片(不加一抗但是加二抗系统/不加任何抗体两组),所有操作过程应完全一致。
染色弱或者没有染色(按照先后顺序,先排除一些简单的原因):

试剂使用顺序错误或者漏加试剂重复实验,保证每一步均正确
二抗和一抗不匹配选择匹配的二抗
底物和酶不匹配选用匹配的底物
酶失活换用新的酶(将酶和底物混合,看是否显色?)
组织中没有待测抗原表达或者表达水平低使用阳性对照片
抗体浓度太低增加抗体浓度.使用不同浓度的抗体,决定zui佳浓度
抗体孵育时间不充分延长抗体孵育时间
底物孵育不充分延长底物孵育时间
抗体储存不当,导致失效将抗体分装,低温保存 (-20 to -70 C) ,避免反复冻溶。稀释抗体在4保存1-2周,避免时间过长。或者根据说明书进行恰当的保存
一抗失效换用新的一抗
二抗失效换用新的抗体(能否成功与其它一抗配合?)
脱石腊不充分延长脱腊时间或者换用新的二甲苯
组织固定不充分或者不当增加固定时间或者改用不同的固定方法
组织固定过度减少固定时间。若已固定过度,则需使用正确的或者推荐的抗原修复方法
复染试剂与底物系统不匹配选择正确的复染试剂(不加复染剂,看是否有组织染色?)
封片剂不正确选择正确的封片剂

 

染色背景高:
可能原因解决办法
洗片不充分每步之间至少洗片3次
组织含有内源性的酶,如HRP/AP在加入一抗之前使用3%的H2O2甲醇封闭内源性HRP活性,使用左旋咪唑(levamisole)溶液阻断内源性AP活性。或者换用葡萄糖氧化酶系统
组织含有内源性生物素(尤其是肾脏、肝和脾)在加入一抗之前,血清封闭之后使用avidin/biotin阻断试剂。或者避免使用biotin-avidin系统或改用IF方法(直接将酶和底物加到组织片上,看是否显色?)
一抗的非特异性结合或者抗体浓度过高增加一抗的稀释度
二抗和组织非特异性结合使用与二抗来源相同的正常动物血清(一般是10%)封闭,必要时可以将血清浓度加大
组织固定不充分,抗原扩散Increase duration of postfixation
使用小鼠来源的二抗检测小鼠组织在加一抗之前使用MouseOnMouse封闭试剂
干片染色过程中避免出现干片现象
 
 
染色强度过大:
可能原因 解决办法
一抗或者二抗浓度过高降低抗体浓度。或者使用不同的浓度,决定zui佳染色浓度
孵育时间过长减少孵育时间
孵育温度太高降低孵育温度,在4℃过夜或者37℃0.5-1小时或者RT
底物孵育时间过长减少孵育时间
干片染色过程中避免出现干片现象

 

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