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选择流式抗体的六要素点击次数:888 发布时间:2017-03-17

  1. 满足抗体选择的基本条件
  靶蛋白特异性:确定目的细胞的特异性表面标记或者胞内标记,知道您要检测什么。
  种属:严格按照待测样本种属选择抗体来源,流式抗体基本无法进行种属间交叉反应。
  应用领域:可用于流式实验,说明书中明确标注经FC实验测试,有实验数据图和用量说明;
  抗体克隆号:一般选择参考文献上提到的克隆;同一抗体多个克隆号的情况下,可以选择荧光标记种类zui多的那个克隆。
  2. 确定流式细胞仪的参数配置
  在设计流式方案前,根据可能需要同时检测指标的多少数量,先确定需要在哪台使用流式细胞仪检测的型号,对该仪器的参数配置,要了解以下几个方面信息:
  激光器:常见的流式细胞仪有488nm和635nm633nm两个激光器,但有些机器在购买时因某些原因,只装了一个488nm激光器,所以需要注意型号相同的机器也未必激光配置相同。
  滤光片:也就是有几个检测通道,这决定了你zui多可以同时检测几个指标。
  仪器的具体型号:有助于再次确定检测通道。因为同一个荧光在不同的流式细胞仪上检测,有时候检测通道也是不一样的。
  3. 荧光的选择建议
  直标还是间标(Biotin):待测抗原表达高的尽量选择直标抗体,待测抗原表达丰度低的要考虑选间生物素标记标抗体。
  荧光强弱:荧光本身有强弱之分,可视抗原表达强弱及分群情况选择合适的荧光。如抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光例如:PE、APC;反之,抗原表达强或分群明显的建议选择zui常用的弱荧光例如FITC即可(常用荧光强弱排序程度为:PE>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC),具体荧光信息请参考荧光染料信息;
  类似荧光的权衡:可以尝试选择新型荧光Alexa Fluor、eFluor等。因为这些荧光非常明亮,对激光稳定性好,对PH 值不敏感,具有水溶性。(如Alexa Fluor488与FITC检测通道相同,但是荧光强度和光敏感上,前者明显优于后者)
  4. 多色荧光搭配的原则
  多色分析方案中荧光抗体的选择和搭配,会受到很多因素的制约,是一个难点:
  检测通道不能冲突:每个检测通道只能选择1种荧光素,各通道之间的荧光素可以随意搭配(如FL1选择了FITC标记的抗体,就不能再选择Alexa Fluor488标记的抗体;而同组实验的其余抗体选择PE或者APC标记,都是可以随意组合的);
  荧光强弱:所选各种荧光素光谱的重叠应当尽量减少,否则将会导致较大的补偿。例如,PE-Ccy5与APC同时标记,将会导致补偿过度,需换成PE-Ccy5.5或PerCPcp-Ccy5.5。zui常用的4色荧光搭配是:FITC、PE、PercpPerCP-Ccy5.5、APC;
  多色荧光搭配:多色分析往往会因个别抗体荧光素种类极少而受到限制,需要同时参考多家抗体公司的产品进行方案设计。因此如遇5色以上分析需求,建议咨询莱兹生物。
  5. 抗体使用剂量
  同一个产品通常会提供多个规格供您选购,可以根据实验的具体样本量和说明书建议用量来确定抗体用量:
  细胞数:通常情况下流式检测一次的样本量为106~108个细胞,建议对样本做细胞计数,以保证抗体标记效果*;
  Test包装:以test为计量单位的抗体,按照每test细胞悬液体积计算出每次加入多少ul抗体即可;
  Ug包装:以ug为计量单位的抗体,需要根据说明书每次抗体加入多少ug先算出能使用的次数,再通过总体积算出每次加入多少ul抗体。
  6. 同型对照抗体的选择
  同型对照(Isotype Control),是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色,是真正意义上的流式阴性对照,流式细胞实验不可或缺的一项。
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